人皮肤真皮组织中角朊干细胞样细胞的分离与培养

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2013.23.012

中国组织工程研究 ›› 2013, Vol. 17 ›› Issue (23): 4264-4271.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2013.23.012

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人皮肤真皮组织中角朊干细胞样细胞的分离与培养

池光范, 李美英，赵贵芳，邓继鸿，刘晋宇，李玉林

吉林大学白求恩医学院病理生物学教育部重点实验室，吉林省长春市 130021

出版日期:2013-06-04 发布日期:2013-06-04
通讯作者: 池光范，男，1970年生，黑龙江省海林市人，朝鲜族，2002年吉林大学毕业，博士，副教授，硕士生导师，主要从事干细胞与再生医学的研究。 guangfan130@jlu.edu.cn
作者简介:池光范，男，1970年生，黑龙江省海林市人，朝鲜族，2002年吉林大学毕业，博士，副教授，硕士生导师，主要从事干细胞与再生医学的研究。 guangfan130@jlu.edu.cn
基金资助:
吉林大学引进人才研究启动基金。

Isolation and cultivation of keratinocyte stem-like cells from human skin dermis

Chi Guang-fan, Li Mei-ying, Zhao Gui-fang, Deng Ji-Hong, Liu Jin-yu, Li Yu-lin

Key Laboratory of Pathobiology, Ministry of Education, Norman Bethune College of Medicine, Jilin University, Changchun 130021, Jilin Province, China

Online:2013-06-04 Published:2013-06-04
Contact: Chi Guang-fan, Associate professor, Master’s supervisor, Key Laboratory of Pathobiology, Ministry of Education, Norman Bethune College of Medicine, Jilin University, Changchun 130021, Jilin Province, China guangfan130@jlu.edu.cn
About author:Chi Guang-fan, M.D., Associate professor, Master’s supervisor, Key Laboratory of Pathobiology, Ministry of Education, Norman Bethune College of Medicine, Jilin University, Changchun 130021, Jilin Province, China
Supported by:
Scientific Research Foundation for the Talent Introduction of Jilin University

摘要/Abstract

摘要：

背景：皮肤真皮组织是皮肤损伤修复时除表皮基底层以外可形成表皮层结构的重要干细胞来源。
目的：探索从人皮肤真皮组织中分离培养角朊干细胞样细胞的新方法。
方法：将一定大小的成人腹部全层皮肤组织用Dispase 过夜消化后去除表皮层结构，然后用0.1% Ⅰ型胶原酶过夜消化，离心分离以获取真皮来源总细胞。将分离的细胞用含有体积分数1% N₂，2% B27，20 μg/L表皮生长因子和40 μg/L 碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12(1∶1)无血清培养液悬浮后以低密度接种于培养皿进行培养。采用RT-PCR和免疫细胞荧光染色法对其进行分析。
结果与结论：RT-PCR分析结果显示所分离的真皮细胞中含有表达Lgr5和Lirg1等特异基因的毛囊来源干细胞；免疫细胞荧光分析结果显示其表达细胞角蛋白8和细胞角蛋白14。在无血清条件下培养6 d时，可观察到表达细胞角蛋白14和整合素α6的“铺路石”样细胞克隆。进行传代培养后P1细胞表达角朊干细胞标志物CD29、细胞角蛋白14和P63。传代培养至P3，4时大部分细胞分化，不能继续传代。结果证实，以无血清培养液结合低密度培养法可直接从人真皮组织中有效地培养增殖活跃、细胞角蛋白14和P63阳性的角朊干细胞样细胞。

关键词: 干细胞, 干细胞培养与分化, 人皮肤, 真皮, 汗腺, 毛囊, 角朊细胞, 细胞角蛋白14, 细胞角蛋白8, CD29, 基因, 其他基金, 干细胞图片文章

Abstract:

BACKGROUND: Skin dermis is an essential stem cell source, except basal layer of epidermis, for forming epidermis structure during the process of skin wound healing.
OBJECTIVE: To explore a new method for isolating and culturing keratinocyte-stem like cells from human skin dermis.
METHODS: Definitive sizes of full skins from adult abdomen were digested with dispase overnight and the epidermal structure was discarded. The remaining dermis were digested with 0.1% type I collagenase overnight. Thereafter, the digested cells were collected by centrifugation, suspended in serum-free Dulbecco’s modified Eagle’s medium/nutrient mixture F12 (1:1) containing 1% N₂, 2% B27, 20 μg/L epidermal growth factor, 40 μg/L basic fibroblast growth factor, and cultured at a low cell density. The isolated and cultivated cells were analyzed by reverse transcription-polymerase chain reaction and immunofluorescence analysis.
RESULTS AND CONCLUSION: The reverse transcription-polymerase chain reaction analysis showed that, the cells isolated from dermis contained hair follicle stem cells expressing Lgr5 and Lirg1. The immunofluorescence analysis showed that, the cells isolated from dermis expressed cytokeratin 8 and cytokeratin 14. After cultivated in serum-free media for 6 days, some cytokeratin 14 and integrin-α6 positive cell colonies appeared “paving stone” like morphology. The passage 1 cells expressed keratinocyte stem cell markers, such as cytokeratin 14, CD29 and P63. The cell proliferation rate was declined with passage times and almost all cells were terminally differentiated at passage 3 or 4. Experimental findings indicate that, keratinocyte stem-like cells expressing CD29, cytokeratin 14 and P63 can be successfully isolated from human skin dermis by directly cultured at a low density and in serum-free media.

Key words: stem cells, stem cell culture and differentiation, human skin, dermis, sweat gland, hair follicle, keratinocyte, cytokeratin 14, cytokeratin 8, CD29, gene, other grants-supported paper, stem cell photographs-containing paper

中图分类号:

R394.2

池光范, 李美英，赵贵芳，邓继鸿，刘晋宇，李玉林. 人皮肤真皮组织中角朊干细胞样细胞的分离与培养[J]. 中国组织工程研究, 2013, 17(23): 4264-4271.

Chi Guang-fan, Li Mei-ying, Zhao Gui-fang, Deng Ji-Hong, Liu Jin-yu, Li Yu-lin . Isolation and cultivation of keratinocyte stem-like cells from human skin dermis[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2013, 17(23): 4264-4271.

图/表（结果） 6

2.1 分离皮肤真皮细胞结果 由于Dispase可选择性分解存在于基底膜中的纤维连接素和Ⅳ型胶原，因此经Dispase 4 ℃过夜处理后，皮肤表皮基底层与真皮层的连接变得极为松散，很容易将完整的表层从真皮表面剥离并去除。经Dispase消化后可将完整的表皮结构从与真皮相连的部位干净地剥离，从而防止了后续分离步骤中表皮基底层来源细胞角蛋白14阳性角朊干细胞的污染。经胶原酶消化后，真皮层被消化成较粘稠的胶状液体，然后追加10-20 mL含体积分数5%胎牛血清的PBS对其进行反复吹打，再依次用70 μm和40 μm细胞滤器过滤，最终分离的真皮组织细胞绝大部分为单个细胞，少部分为由2-5个细胞所构成的细胞团块。见图1。
2.2 分离的真皮细胞混合物中含有毛囊隆突和汗腺来源干细胞 将分离的细胞直接用40 g/L多聚甲醛固定后，用细胞角蛋白8和细胞角蛋白14进行免疫细胞荧光染色分析，可观察到细胞角蛋白8和细胞角蛋白14阳性细胞，见图2。从分离的细胞中提取mRNA进行RT-PCR分析，可检测到Lgr5、Lirg1、CD200、k5和Tcf3基因的表达，见图3。提示分离的细胞中含有毛囊来源的干细胞存在^[4-7]。

2.3 培养细胞角蛋白14阳性角朊干细胞样细胞结果 将细胞以0.5×10⁷ L^-1的浓度悬浮于含体积分数1%N₂、2%B27、20 μg/L 表皮生长因子和40 μg/L 碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12(1∶1)培养基中。培养两三天时可观察到大部分细胞贴壁于培养皿底部，以单个细胞形态存在。培养6 d时，观察到由单个扁平状细胞快速分裂增殖形成细胞间胞膜紧贴、轮廓清楚、折光性强的“铺路石”样细胞群落。培养12 d时，经结晶紫染色后可观察到6-12个直径约3 mm的细胞克隆。上述细胞的细胞形态及增殖特性符合角朊干细胞的“高细胞扩增率、高克隆形成面积、高克隆形成率”的特点^[8] 。如果把从真皮中分离的细胞置于KGM-2培养液中培养，则细胞增殖时间慢、培养出的“铺路石”样细胞克隆数少且直径小，但在进行传代培养时反而在KGM-2培养基中长势良好。此外还发现：如果将从表皮中分离的细胞置于实验中所使用的原代培养液中进行培养，则细胞不容易增殖且很难观察到“铺路石”样细胞克隆，见图4，5。

原代培养时，细胞群落之间有少量成纤维样细胞和血管内皮样细胞稀疏分布，培养6-8 d期间，其增殖速度缓慢，但在原代培养后期即9-12 d，成纤维细胞增殖逐渐加快，培养12 d左右时细胞达90%融合，呈“铺路石”样的细胞群落与成纤维细胞间界限明显。
传代后，细胞在KGM-2培养液中迅速贴附于培养瓶底部，但与原代相比细胞增殖较缓慢，不形成在原代培养中所观察到的圆形或椭圆形细胞克隆，且随传代次数的增多细胞体积增大，圆盘状，呈终末分化形态的细胞比例逐步增多，P3代时大部分细胞终末分化为表面积较大的圆盘状。
CD29、细胞角蛋白14和P63是角朊干细胞的标志物^[9-11] 。原代培养3 d时，经免疫细胞荧光染色可观察到约1% CD29和细胞角蛋白14阳性共染的细胞，这些双阳性细胞分裂增殖形成细胞角蛋白14阳性的“铺路石样”细胞克隆群落。P1代时CD29、细胞角蛋白14和P63呈阳性的细胞占细胞总数的90%以上，但是P2代和P3代时CD29和细胞角蛋白14共染细胞所占比例分别降为约40%和10%，见图6。

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引言

材料方法

设计：细胞分离培养与鉴定实验。
时间及地点：于2011年9月至2012年7月在吉林大学白求恩医学院病理学教研室完成。
材料：
人皮肤真皮组织源性角朊干细胞样细胞的分离培养实验主要试剂及仪器：
Main experimental reagents and instruments:

经伦理委员会批准和相关家属同意, 自吉林大学中日联宜医院外科手术室获取45-50岁患者的正常腹部皮肤(大小约为长2.5 cm ×宽1.0 cm)。
实验方法：
表皮和真皮组织的分离：在超净台内，用眼科剪去除皮下脂肪组织，用含有5倍双抗(青霉素和链霉素)的PBS清洗两三次，以去除残留的血液成分，然后将其剪成约3 mm×3 mm大小的皮肤块，置于含0.48% Dispase的DMEM/F12(1∶1)培养基中，4 ℃消化过夜。次日，用眼科镊把皮肤表皮层揭去，置于另一盛有PBS的平皿中，用于分离表皮角朊细胞。剩下的真皮组织用PBS漂洗2次，去除残留的表皮成分。
真皮角朊样细胞的培养：将清洗后的真皮用手术剪刀剪成细小的组织碎块，然后移入50 mL离心管中，加入30 mL含有体积分数1%胎牛血清和1 g/L Ⅰ型胶原酶的DMEM/F12(1∶1)培养基，置于37 ℃孵箱内消化过夜(约10 h)。次日用含体积分数2%胎牛血清的PBS终止消化。然后依次过70 μm和40 μm滤网，去除残余的组织块。以1500 r/min离心5 min，去除上清液，用20 mL PBS吹打后再以1 500 r/min离心5 min，最后将细胞沉淀吹打悬浮于含有体积分数1%N₂、2%B27、20 μg/L表皮生长因子和40 μg/L 碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/ F12(1∶1)培养基，以0.5×10⁷ L^-1细胞浓度接种于75T培养瓶中进行培养。培养四五天后更换全部培养液，此后每3 d更换2/3培养液，持续培养。
当角朊样细胞克隆长到一定大小、与周边的细胞基本融合时，用2.5 g/L胰蛋白酶-0.02%EDTA进行消化。首先控制消化时间≤ 5 min，以分离成纤维样细胞。至成纤维样细胞基本消化下来且上皮细胞/角朊样细胞克隆保持完整时，吸弃含有细胞的消化液，用PBS轻轻漂洗2次并弃掉。然后在培养皿内追加适量2.5 g/L胰蛋白酶，消化约10 min，相差显微镜下观察至细胞基本消化下来时，添加含有体积分数2% 胎牛血清的PBS终止消化，轻轻拍打平皿并用移液器反复吹打，使细胞与平皿充分解离。将消化下来的细胞收集于50 mL离心管中，以1500 r/min离心5 min，然后弃上清液，将细胞沉淀吹打悬浮于KGM-2培养基，以2×10⁷ L^-1细胞浓度接种，每隔3 d更换2/3培养液进行培养。至细胞达到80%-90%融合时，以1∶3的比例进行传代培养。
传代培养用含2.5 g/L胰蛋白酶-0.02%EDTA的消化液处理2-5 min，消化至绝大部分成纤维细胞从培养瓶表面分离，然后将其吸弃，加PBS轻轻漂洗20次，再加2.5 g/L胰蛋白酶-0.02% EDTA消化约10 min，进而获取角朊干细胞。
真皮角朊样细胞鉴定：按上述方法从3块来自不同供体的皮肤中分离真皮细胞后，不经细胞培养直接进行RT-PCR和免疫细胞荧光染色分析。
将一部分细胞用RNeasy Mini Kit处理，提取总RNA，然后使用Super Script first-strand system for RT-PCR进行反转录PCR，即以1 μg RNA为模板合成cDNA，再以浓度为100 μg/L 的cDNA为模板进行PCR反应。反应体系为25 μL，包括cDNA 3 μL、10×PCR Buffer 5 μL、dNTP Mixture 2 μL、特异上游引物0.5 μL、特异下游引物0.5 μL、TaKaRa Ex-TaqHS 0.5 μL，最后加RNase Free dH₂O至25 μL。反应条件如下：变性， 94 ℃ 40 s；退火，55 ℃ 40 s；延伸，72 ℃ 40 s (35个循环)。最后采用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，凝胶成像拍照系统记录结果。用于PCR反应的引物见表1。

将部分上述细胞沉淀用40 g/L多聚甲醛固定，然后用OCT包埋，制10 μm厚度冷冻切片，粘贴于涂有多聚赖氨酸的载玻片。待其自然干燥后，用PBS冲洗3×5 min，然后滴加0.2% triton x-100，室温孵育10 min。PBS冲洗3×5 min。用体积分数10%羊血清封闭1h，然后分别滴加细胞角蛋白8 (CK8，1∶200) 和细胞角蛋白14(CK14，1∶1 000)，4 ℃过夜。次日，将载玻片用PBS冲洗3×联单5 min，然后滴加羊抗小鼠IgG-Texas Red(1∶200)，室温孵育1 h，再用PBS冲洗3×5 min。DAPI染核。封固剂封固后置于荧光显微镜下观察并照相。
培养扩增P1-P3细胞，接种于24孔板，培养3 d后以40 g/L多聚甲醛固定10 min，然后用PBS冲洗3×5 min。滴加0.2% triton x-100，室温孵育10 min，再用PBS冲洗3×5 min。以体积分数10%羊血清封闭1 h后，滴加细胞角蛋白14(1∶1 000)，CD29 (1∶1 000)和P63(1∶200)，4 ℃过夜。次日，将载玻片用PBS冲洗3×5 min，分别滴加羊抗小鼠IgG-FITC (Vector，1∶200)或IgG-Texas Red (1∶200)，室温孵育1 h，再用PBS冲洗3×5 min。DAPI染核后, 用封固剂封固，置于荧光显微镜下观察并照相。
主要观察指标：①分离皮肤真皮细胞结果。②分离的真皮细胞混合物中是否含有毛囊来源的干细胞。③培养细胞角蛋白14阳性角朊干细胞样细胞结果。

讨论

由于皮肤表皮基底层来源的角朊干细胞数目少、随年龄增加数量减少且在体外培养过程中极易分化，因此如何在较短时间内获取足够数量的角朊干细胞应用于组织工程皮肤构建和皮肤损伤修复已成为难题。据报道，位于皮肤真皮的毛囊和汗腺也是皮肤表皮损伤修复中所需角朊干细胞的细胞源^[12-14]。因此，如果能有效分离培养上述真皮中的干细胞，并与表皮中的角朊干细胞联合应用进行皮肤修复，不仅能解决表皮来源角朊干细胞数量不足的问题，同时能缩短体外培养角朊干细胞的时间，从而构建出更理想的组织工程皮肤，有望在临床应用中得到更好的治疗效果。实验结果说明：不经挑选毛囊和汗腺，直接将从真皮消化下来的细胞进行低密度、无血清培养，可纯化、获取表达角朊干细胞标志物CD29、细胞角蛋白14和P63的角朊干细胞样细胞。
目前，从人汗腺中分离培养角朊细胞多采用以下方法：用胶原酶消化皮肤组织后，在实体显微镜下用镊子或昆虫针挑取并收集汗腺，再接种于培养皿进行组织块培养，当从组织块中迁移出的细胞达到一定密度时用消化液分离细胞并进行传代培养^[15-18]。这种方法存在挑选难度大、消耗时间、用于细胞培养的时间长等缺陷，仅适合于汗腺组织的再生和重建研究。存在于躯体部位皮肤的毛囊不如头发和腋下毛囊体积大、易识别，且若经胶原酶消化后再反复吹打真皮组织，可导致真皮中的毛囊结构破坏消失，因此在消化下来的组织中挑选毛囊结构进行毛囊来源角朊干细胞的培养具有很大难度。
文章报道的实验方法避免了上述诸多弊端。同时RT-PCR结果表明最终消化得到的细胞中确实含有表达Lgr5、Lrig1、CD200、K5、Tcf3等特异基因的毛囊干细胞，由此可以断定原代培养得到的角朊干细胞样细胞中一部分为毛囊来源干细胞，但尚且无法确定其所占比例。实验采用将从真皮中消化下来的细胞进行直接培养的方法获取角朊干细胞样上皮细胞，有效避免了上述挑选方法的不足并最大限度地收集了原有的真皮角朊干细胞样上皮细胞，从而在原代培养的较短时间内获得了更多细胞活性良好的角朊干细胞样上皮细胞。
表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子是角朊干细胞增殖刺激生长因子。实验中原代培养所使用的无血清培养液主要用于神经脊干细胞和中枢神经干细胞的悬浮培养^[19-21]，其表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的含量明显高于商品化的表皮角朊干细胞培养液。最近的研究结果表明高剂量(100 μg/L)的碱性成纤维细胞生长因子可使终末分化的角朊细胞去分化为表达CD29、细胞角蛋白14和细胞角蛋白19的角朊干细胞^[22]。因此，推测在实验中应用的碱性成纤维细胞生长因子浓度(40μg/L)不仅刺激了原有角朊干细胞样细胞的增殖，还可能对原有的角朊干细胞的细胞学特性的保持和部分终末分化的角朊细胞分化为干细胞起了一定的重要作用。
由于汗腺来源干细胞不仅具有形成皮肤表皮结构的性质，还具有形成汗腺结构的固性；同样毛囊来源干细胞不仅能演变为表皮角朊干细胞，还具有与真皮中的中胚层细胞相互作用形成毛囊结构的性质^[23-25]。因此，将以这种方法得到的角朊干细胞与表皮角朊干细胞以及其他真皮细胞一起联合应用进行皮肤损伤的修复，可期待在修复的皮肤中观察到良好的表层结构，同时还可观察到毛囊和汗腺结构，从而达到理想的皮肤修复效果。下一步将利用真皮源性角朊样干细胞进行动物皮肤损伤实验，观察其皮肤损伤修复效果，以证明真皮源性角朊样干细胞具有角朊干细胞得特性和形成毛囊及汗腺的能力。
总而言之，实验利用高剂量表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子，在无血清的培养条件下从小块人真皮组织中成功分离培养了角朊干细胞样细胞，为组织工程皮肤的构建和皮肤损伤修复提供了新的细胞培养方法。

文章快阅

延伸阅读

1 实验设计及文章构思：
本实验以含高浓度EGF和bFGF的无血清培养液作为细胞原代培养液，在低密度培养条件下成功培养了真皮源性角朊干细胞样上皮细胞。首先，用Dispase消化处理后，在实体显微镜下剥离和除净表皮层，严格排除了表皮基底层角朊干细胞残留在真皮层的可能性，并用免疫组织化学方法证明了CK14阳性的表皮基底层角朊干细胞已随表皮层的剥离而除净。其次，分别用RT-PCR和免疫细胞荧光染色方法证明了从真皮中分离的细胞中含有毛囊源性干细胞和汗腺源性干细胞，并且经体外培养后可形成具有“高细胞扩增率、高克隆形成面积、高克隆形成率”生长特点，同时表达CK14和integrin α6的细胞克隆。最后，经传代培养证实细胞可自我更新、表达角朊干细胞标志物CD29、CK14和P63。
2 课题设计中区别于国内外相关研究的特点：
本实验以下两点与相关研究不同：
首先，在国内外利用毛囊和汗腺来源干细胞进行皮肤损伤修复的研究中，都采用了分离毛囊和挑选汗腺后进行组织块培养的方法，培养、纯化毛囊或汗腺干细胞。但在本研究中直接把从真皮组织中分离收集的细胞进行单层培养，不仅省去了麻烦和耗时的挑选步骤，还尽可能保留了存在于真皮中的毛囊和汗腺来源细胞，最大限度地提高了原代培养中毛囊和汗腺来源细胞的含量。
其次，本研究在进行原代培养时与其它相关研究不同，采用了含高剂量EGF(20ng/ml) 和bFGF (40ng/ml) 的无血清培养液进行细胞培养，并证明了其具有有效性。
3 文章学术水平与国内外同类研究的比较：
目前，在利用细胞进行皮肤组织损伤的再生修复研究中遇到的难题之一是所修复的皮肤中表皮与周边正常表皮厚度和表皮细胞分布略有不同，并且缺少或无毛囊和汗腺结构，因此不具备保护和分泌汗液等正常皮肤功能。这些问题主要与细胞治疗中所应用的自体角朊干细胞数非常有限和提供的细胞中不含可形成毛囊和汗腺组织的干细胞有关。由于覆盖在大部分躯体表面的皮肤中主要含有小毛囊和小汗腺，其结构与大毛囊和大汗腺不同，因此即使利用大毛囊和大汗腺来源的细胞用于皮肤再生，所形成的大毛囊和大汗腺结构也不适于修复部位的皮肤，反而影响皮肤的美观。因此，如果利用本方法从真皮中分离细胞进行皮肤损伤的修复，不仅能形成更好的表皮结构，同时真皮中含有与周边组织相似的小毛囊和小汗腺结构，可达到更完美的修复效果。
本研究不挑选毛囊和汗腺，用高剂量EGF和bFGF在无血清培养条件下从真皮中分离和培养表达CD29、CK14和P63的角朊干细胞样上皮细胞，处于国内外领先水平。
4 文章特点：
①以毛囊（hair follicle）、干细胞（stem cell）和表皮（epidermis）为关键词检索PubMed 数据库2002-01/2012-08 年文献所得的结果为747 篇。
②用检索词为汗腺（sweat gland）、上皮细胞（epithelia cell）为关键词检索PubMed数据库2002-01/2012-08年文献所得的结果为881篇。
③用检索词为汗腺（sweat gland）、干细胞（stem cell）和表皮（epidermis）为关键词检索PubMed 数据库2002-01/2012-08 年文献所得的结果为28篇。说明毛囊和汗腺干细胞/细胞研究是当前研究热点。
④以人皮肤（human skin）,真皮（dermis）, 毛囊（hair follicle），汗腺（sweat gland）, 干细胞（stem cell）和培养（culture）为关键词检索PubMed 数据库2002-01/2012-08 年文献所得的结果为0 篇，说明该文的方法目前尚无或文献报道较少，具有创新性。

人皮肤真皮组织中角朊干细胞样细胞的分离与培养

Isolation and cultivation of keratinocyte stem-like cells from human skin dermis

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